siRNA產(chǎn)品
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小干擾 RNA(siRNA),有時(shí)稱(chēng)為短干擾RNA 或沉默 RNA,是一類(lèi)雙鏈 RNA 分子,長(cháng)度為 20-25 個(gè)堿基對,類(lèi)似于 miRNA,并且在 RNA 干擾(RNAi)途徑內操作。它干擾了表達與互補的核苷酸 序列的特定基因的轉錄后降解的 mRNA,從而防止翻譯。siRNA 合成是機體或細胞實(shí)現基因沉默 最為簡(jiǎn)捷的方法,轉染效率高,對細胞的或者組織的毒副作用小、可大規模制備等優(yōu)點(diǎn),特別適 用于基因靶位點(diǎn)不確定情況下,進(jìn)行siRNA 有效片段的篩選。siRNA 在基因功能研究、藥靶及藥物篩選等領(lǐng)域具有不可替代的優(yōu)勢。

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小干擾 RNA(siRNA),有時(shí)稱(chēng)為短干擾RNA 或沉默 RNA,是一類(lèi)雙鏈 RNA 分子,長(cháng)度為 20-25 個(gè)堿基對,類(lèi)似于 miRNA,并且在 RNA 干擾(RNAi)途徑內操作。它干擾了表達與互補的核苷酸 序列的特定基因的轉錄后降解的 mRNA,從而防止翻譯。siRNA 合成是機體或細胞實(shí)現基因沉默 最為簡(jiǎn)捷的方法,轉染效率高,對細胞的或者組織的毒副作用小、可大規模制備等優(yōu)點(diǎn),特別適 用于基因靶位點(diǎn)不確定情況下,進(jìn)行siRNA 有效片段的篩選。siRNA 在基因功能研究、藥靶及藥物篩選等領(lǐng)域具有不可替代的優(yōu)勢。

普通siRNA


普通siRNA


  • 合成的 RNA 凍干粉?

  • COA 文件?

  • 檢測報告 (MS & HPLC)

siRNA產(chǎn)品


RNA訂購單

文件名稱(chēng):

技術(shù)原理

RNA干擾(RNAinterfering,RNAi)現象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過(guò)程。細胞中的核糖核酸酶III家族成員之一的,dsRNA特異性的核酸酶Dicer將dsRNA裂解成由21-25個(gè)核苷酸組成的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA),隨后siRNA作為介導子引起特異性地降解相同序列的mRNA,從而阻斷相應基因表達的轉錄后基因沉默機制。

普通siRNA

1、公司提供的 siRNA 是雙鏈的還是單鏈的?

公司的 siRNA 是雙鏈的,而且也是按照雙鏈來(lái)定價(jià)的。

2、我們需要提供什么信息用于 siRNA 的合成?你們可以幫助免費設計

嗎?

您需要準確地提供 siRNA 19 個(gè)核昔酸的靶序列和懸垂的合成物,或者您也可以提供相應地基因的 GeneID 或者 Accession Number,由我們公司技術(shù)人員為您免費設計。

3、如何選擇 siRNA 的懸垂組成?

懸垂的序列組成是由顧客自行選擇的。最近研究表明懸垂的組成在mRNA 靶識別和酶解中不是很重要。懸垂可能在形成 RISC 的過(guò)程中起結構的作用。很多研究人員選擇 dTdT 是因為研究表明脫氧核糖核昔能保護 siRNA 免受酶解。合成序列最重要的是確定靶mRNA 19 個(gè)堿基的核心結構。

4、針對人體基因設計的 siRNA 對其他物種是否也有效?

一般 siRNA 都具有物種特異性,很少與其他物種有相同的靶位點(diǎn),所以針對人體基因設計的 siRNA 不會(huì )沉默其他物種的同源序列。然而,也有研究表明 siRNA 經(jīng)過(guò)特異性設計后能對兩個(gè)或兩個(gè)以上的物種有效,這需要仔細進(jìn)行 siRNA 設計和生物信息學(xué)分析。

5、你們提供的 siRNA 是怎樣裝運的?如果在常溫下放置了一個(gè)星期,還有效嗎?

公司為您提供的 siRNA 是凍干粉包裝的,在常溫下運輸。這些凍干的樣品在室溫下能穩定保存 2-4 個(gè)星期,所以放置一個(gè)星期不會(huì )影響其沉默效果。但我們建議您收到樣品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷凍箱中。

6、在體外實(shí)驗中,需要多少量的 siRNA?

我們建議您用于實(shí)驗的 siRNA 的濃度為 100nM。1nmol siRNA 的量對于一個(gè) 24 孔板或是 96 孔板的實(shí)驗已經(jīng)足夠了。

7、用 100nM siRNA 轉染時(shí)只得到 50%沉默效率,我可以將 siRNA的濃度增加到200nM 甚至 400nM 嗎?

增加 siRNA 的濃度一般不能改進(jìn)沉默效率。高濃度的 siRNA 將可能導致去靶作用和對細胞的毒性。siRNA 的高基因沉默效率來(lái)自于合理的設計,在 100nM 甚至更低的濃度都可能有 75%的沉默效率。另外,低的轉染效率會(huì )導致低的沉默效率,建議您更進(jìn)一步優(yōu)化

siRNA 的導入條件。

8、定量 RNA 的公式是什么?

研究者可以用 Beer 法則定量 RNA:吸光度(260nm)=(摩爾消光系數)*(濃度)*(路徑氏度,cm)。為了便于理解,等式變?yōu)椋簼舛龋?/span>(吸光度,260nm)/[(摩爾消光系數)*(路徑氏度,cm)]。當使用一個(gè)標準的10mm 比色皿時(shí),在公式中路徑氏度這個(gè)變量等于1。

6μl 濃度為 10uM siRNA 溶解液中含有多少μg siRNA?

首先計算含有多少 nmol siRNA

a. 等式: ?nmol=(6μl)(10umol/L);

b. 單位換算: ?nmol= (6μl)(10μmol/L)(1L/1,000,000μl)(1,000nmol/μmol);

c. 答案: ?nmol=0.06nmol。

然后利用 siRNA 的平均分子量(13,300g/mol)*nmol 變?yōu)?/span>μg

a. 等式: ?μg=(0.06nmol)(13,300g/mol);

b. 單位換算: ?μg=(0.06nmol)(13,300g/mol)(1mol/1,000,000,00 0nmol)(1,000,000μg/g);

c.答案: ?μg=0.798 0.8μg。所以 6μl 濃度為 10μM siRNA 溶解液中含有 0.8μgsiRNA。

9、我需要濃度為 20uM 的樣品,如何計算重懸 siRNA 緩沖液的量?

樣品濃度的計算如下:(siRNA 的量,nmol)/(重懸體積,μl)=樣品濃度,μmol/L。在解答前應先統一單位,確保單位可以抵消。例如:您購買(mǎi)了 20nmol siRNA,想溶解為50μM 的樣品??砂匆韵路椒ㄓ嬎阒貞揖彌_液體積:a.等式: (20 nmol)/?μl=50umol/L;b.解答未知量 : ?μl=(20nmol)(1L/50umol) ;

c. 單 位 換 算: ?μl=(20nmol)(1L/50μmol)(1μmol/1,000nmol)(1,000,000μl/1L);

d.答 案: ?μl=400μl。因此,應該使用 400μl 緩沖液去重懸 20nmol siRNA,溶解后為 50μM 的樣品。

10、一定需要陰性對照嗎?

是,陰性對照是 RNA 干擾實(shí)驗中不可缺少的。由于在超過(guò) 200nM 的濃度下,siRNA 有可能會(huì )導致非特異性的壓力反應,在實(shí)驗體系中必需設置陰性對照。它能夠幫助我們確認基因表達水平的降低是否是序列特異性的 RNAi 的結果。由于 siRNA 的合成方法和工藝以及轉染試劑等因素可能導致廣泛的基因沉默現象。如果沒(méi)有陰性對照,研究人員很可能錯誤地將廣泛的、非特異性基因沉默當作由 RNAi 引起的基因特異性沉默。

11、常用的陰性對照有哪些類(lèi)型?

常用的陰性對照大體分為兩種,一種是使用通用陰性對照序列,該序列已經(jīng)被上千篇文章使用;另一類(lèi)是使用和靶基因 siRNA 打亂序列的 siRNA 作為陰性對照,這樣的陰性對照和通用序列相比較,一方面合成是按照定制產(chǎn)品價(jià)格合成的,另一方面,由于打亂序列是沒(méi)有經(jīng)過(guò)驗證的序列,有可能會(huì )產(chǎn)生 off target 現象。因此,除非有非常特殊的要求,最好使用通用序列作為陰性對照。

12、在陰性對照體系中和實(shí)驗體系中觀(guān)察到同樣的實(shí)驗結果,這是什么原

因?

這個(gè)結果充分說(shuō)明了設置陰性對照的必要性。該結果表明您所觀(guān)察到的表型不是序列特異性 knockdown 產(chǎn)生的表型,您需要降低 siRNA 的工作濃度。為什么說(shuō)陽(yáng)性對照在 RNA 13、干擾實(shí)驗中很重要?

陽(yáng)性對照作為一個(gè)實(shí)驗系統檢查是很重要的。也就是說(shuō),當您看到siRNA 陽(yáng)性對照的預期實(shí)驗結果時(shí),您能確保在您的實(shí)驗方法中您的轉染、RNA 提取物和檢測方法是可靠的。通常最好的陽(yáng)性對照是內在的對照。

14、你們能提供預先合成的 siRNA 對照么?

可以。吉瑪能提供許多預先合成的用于 RNA 干擾實(shí)驗的對照雙鏈。

15、用于對照的 siRNA 的最佳濃度是多少?

陽(yáng)性對照和陰性對照的 siRNA 的濃度都應該與基因特異性的 siRNA的濃度相同。

16、在 siRNA 上進(jìn)行標記的最佳位點(diǎn)在哪里?

反義鏈的 5'端標記會(huì )影響 siRNA 的沉默活性,所以不推薦標記這個(gè)位點(diǎn)。在其他三個(gè)末端進(jìn)行標記對沉默活性幾乎沒(méi)有影響。有研究表明正義鏈的 5'端標記是最有效的化學(xué)合成位點(diǎn)。

17、熒光標記的 siRNA 是不是可以作為良好的對照?如何檢測熒光標

記的 siRNA?

已經(jīng)有為數不少的實(shí)驗室研究過(guò)熒光標記的 siRNA 的熒光檢測結果和 knockdown 效率之間的正相關(guān)關(guān)系。熒光標記雙鏈是最常用的優(yōu)化轉染條件的方法??梢杂昧魇郊毎麅x或者熒光共聚焦顯微鏡檢測標記的 siRNA。

18、熒光素的最大吸收率和収射率各在哪個(gè)波段?

熒光素在 495nm 處有最大吸收率,在 520nm 處有最大發(fā)射率。

19、如何篩選轉染試劑?

好的轉染試劑有以下特點(diǎn):

1. siRNA 有較高的轉染率;

2. 對細胞的毒性小。在mRNA水平檢測 siRNA 導入的效果比用看家基因的siRNA陽(yáng)性對照檢測更為準確。

20、轉染過(guò)程中發(fā)現大量細胞死亡,我應該如何處理?

如果出現細胞大量死亡,意味著(zhù)您的轉染條件仍然需要優(yōu)化:轉染條件的優(yōu)化一般包括以下幾個(gè)方面:

1.調整轉染試劑的濃度;

2.在轉染后適當的時(shí)間內更換無(wú)轉染試劑的培養液;

3.調整細胞的生長(cháng)狀態(tài):一般處于良好生長(cháng)狀態(tài)的細胞對轉染試劑就有更好的耐受性;

4.調整轉染試劑和 siRNA 的比例:如果同一管轉染試劑在不同實(shí)驗中對細胞的毒性有差異,一般說(shuō)來(lái)應該是實(shí)驗過(guò)程本身帶來(lái)的差異:如果已經(jīng)做了以上幾項工作,轉染效率仍然得不到提高,建議您更換一種轉染試劑。

21、如何將 siRNA 導入到細胞內?

使用什么樣的轉染方法,很大程度上取決于您使用的細胞系:

1.貼 壁的、易轉染的細胞,我們推薦使用 Lipofectamin 2000 。

2.懸浮的或 原代的細胞,我們推薦使用電擊轉化方法;

3.電擊轉化效率仍然很低 的細胞,需要選擇載體系統。公司除提供化學(xué)合成的 siRNA 以外,還提供完整的載體系統,請參閱產(chǎn)品資料。

22、我的課題主要是研究細胞凋亡相關(guān)基因,我手上有一些新基因需要使用 RNA干擾進(jìn)行深入研究,我該如何選擇對照系統?

RNAi 進(jìn)行 pathway 研究,是 RNAi 主要應用之一。在這樣的課題中,對照系統的選擇尤其重要。已經(jīng)發(fā)表的和已經(jīng)驗證的 siRNARNA 干擾研究提供了系統性對照。用 RNAi 進(jìn)行細胞凋亡相關(guān)基因的研究,以往已經(jīng)有眾多的文獻報道,可以查閱公司已發(fā)表的文獻。

23、我剛剛開(kāi)始接觸 RNA 干擾技術(shù),從文獻上看,不同細胞應該選用不同的轉染試劑,不同的研究目的,應該使用不同的 siRNA,我的 經(jīng)費有限,如何有效確定我的研究體系?

在開(kāi)始 RNA 干擾研究之初,需要確定以下幾個(gè)方面:使用化學(xué)合成 的 siRNA 還是使用載體構建 shRNA?我們推薦您使用化學(xué)合成的方法來(lái)篩選有效的目的片段,然后把您篩選出來(lái)的目的片段插入到載體,進(jìn)行抗性篩選,得到穩定表達的細胞株,再做長(cháng)期研究。

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